Το φθινόπωρο του 1873 ξεκίνησε σπουδές ιατρικής στη σχολή του Πανεπιστήμιο της Βιέννης. Πέρα από τα καθιερωμένα μαθήματα που απαιτούνταν, παρακολούθησε επίσης με ενδιαφέρον διαλέξεις στη φιλοσοφία. Τον Μάρτιο του 1876, ανέλαβε την πρώτη του πρωτότυπη έρευνα, υπό την επίβλεψη του καθηγητή ζωολογίας Καρλ Κλάους, ο οποίος ήταν επικεφαλής του Ινστιτούτου Συγκριτικής Ανατομίας. Ο Φρόυντ υπήρξε ένας από τους πρώτους επιστήμονες που χρηματοδοτήθηκαν για έρευνα στον Ζωολογικό Πειραματικό Σταθμό που είχε ιδρυθεί στην Τεργέστη. Στο πλαίσιο της έρευνάς του, ασχολήθηκε με τη θαλάσσια ζωολογία και ειδικότερα με το πρόβλημα της γονιδιακής δομής των χελιών. Στο τέλος του τρίτου έτους σπουδών του, ξεκίνησε η συνεργασία του με τον φυσιολόγο Ερνστ Βίλελμ φον Μπρύκε (Ernst von Brücke), ο οποίος αποτελούσε εκπρόσωπο της σχολής φυσιολογίας του Helmholtz, η οποία προσπαθούσε να εξηγήσει όλα τα φαινόμενα στη βάση φυσικοχημικών διεργασιών. Το 1876 έγινε δεκτός στο Ινστιτούτο Φυσιολογίας του Μπρύκε στο πανεπιστήμιο, όπου εργάστηκε κατέχοντας τον τίτλο του famulus, αποτελώντας ερευνητή φοιτητή. Ο Φρόυντ ερεύνησε ένα γένος ψαριών (πετρόμυζον), και ειδικότερα ένα ιδιόμορφο κύτταρό τους, που είχε νωρίτερα ανακαλυφθεί. Η εργασία του εντασσόταν στο πλαίσιο ενός ευρύτερου προβληματισμού, σχετικά με το ερώτημα της εποχής εκείνης αν το νευρικό σύστημα των ανώτερων ζώων διαφέρει από εκείνο των κατώτερων. Η έρευνά του κατέληξε σε μία ανακάλυψη ιδιαίτερης σημασίας, καθώς αποδείκνυε πως τα κύτταρα του νευρικού συστήματος των κατώτερων ζώων εμφάνιζαν μία συνέχεια με εκείνα των ανώτερων. Το 1878, παρουσιάστηκε από τον Μπρύκε στην Ακαδημία και λίγο αργότερα δημοσιεύτηκε στο περιοδικό που εξέδιδε. Το επόμενο διάστημα ασχολήθηκε με το ίδιο γενικό πρόβλημα και υπήρξε ο πρώτος που παρατήρησε το θεμελιώδες χαρακτηριστικό των νευρικών ινών, πως οι κυλινδράξονές τους είναι ανεξαιρέτως ινιδιακοί, σε ό,τι αφορά στη δομή τους. Σύμφωνα με το μαθητή και φίλο του Φρόυντ, Έρνεστ Τζόουνς, οι μελέτες του θα μπορούσαν να τον οδηγήσουν μεταξύ των πρωτοπόρων της νευρωνικής θεωρίας, αν ο ίδιος δεν περιόριζε τις σκέψεις του στις «λογικές και όχι απώτερες συνέπειές τους».^[26]

Το 1879 υπηρέτησε τη στρατιωτική του θητεία, διάρκειας ενός έτους, και στις 30 Μαρτίου 1881 απέκτησε το διδακτορικό του δίπλωμα, αριστεύοντας στις τελικές εξετάσεις. Σε σχέση με την κανονική διάρκεια σπουδών της εποχής εκείνης, ο Φρόυντ καθυστέρησε σημαντικά στη λήψη του διπλώματός του, πιθανώς εξαιτίας της ερευνητικής του δραστηριότητας, η οποία όπως ανέφερε ο ίδιος σε επιστολή του αποτελούσε εμπόδιο στη μελέτη του.^[27] Το επόμενο διάστημα συνέχισε να εργάζεται στο Ινστιτούτο Φυσιολογίας του Brücke, γεγονός που θεωρείται ενδεικτικό της κλίσης του προς την έρευνα και της αποστροφής του προς την άσκηση της ιατρικής. Η θεωρητική του σταδιοδρομία έλαβε τέλος το 1882, όταν εξαιτίας της οικονομικής του κατάστασης αναγκάστηκε να παραιτηθεί από τη θέση του στο ινστιτούτο, προκειμένου να εργαστεί ως γιατρός στο Γενικό Νοσοκομείο της Βιέννης, όπου θα εξασφάλιζε περισσότερα χρήματα. Στην απόφαση αυτή συνέβαλε και η επιθυμία του να παντρευτεί τη Μάρθα Μπέρναϋς (1861-1951), με την οποία είχε αρραβωνιαστεί τον Ιούνιο του 1882 και κατ' επέκταση η ανάγκη του να είναι σε θέση να συντηρήσει μία οικογένεια. Αρχικά επέλεξε να ενταχθεί στα τμήματα που άπτονταν της χειρουργικής, παραμένοντας σε αυτά για δύο μόλις μήνες. Στη συνέχεια εργάστηκε για έξι μήνες στο τμήμα παθολογίας του διακεκριμένου ιατρού Χέρμαν Νότναγκελ, πριν μετατεθεί τελικά στην ψυχιατρική κλινική, στην οποία ήταν επικεφαλής ο διευθυντής του νοσοκομείου Theodor Meynert (1833-92), διακεκριμένος ανατόμος της εποχής. Τον Οκτώβριο του 1883 μετακινήθηκε εκ νέου, αυτή τη φορά στο δερματολογικό τμήμα. Ο Φρόυντ επιθυμούσε να αποκτήσει εμπειρία ειδικότερα στις συφιλιδικές ασθένειες, καθώς η σύφιλη συνδεόταν με τις παθήσεις του νευρικού συστήματος. Στις αρχές του 1884 εργάστηκε επίσης στο τμήμα των νευρικών ασθενειών (Nervenabteilung) όπου αποκόμισε σημαντική εμπειρία.

Οι μελέτες που πραγματοποίησε ο Φρόυντ στο Γενικό Νοσοκομείο, σχετικά με την κλινική χρήση της κοκαΐνης θεωρούνται ιδιαίτερα σημαντικές και χαρακτηρίζουν την αποκαλούμενη «περίοδο της κοκαΐνης» (1884-87). Η πρώτη αναφορά του Φρόυντ πάνω στη χρήση της ουσίας χρονολογείται στις 21 Απριλίου του 1884, όταν σε μία επιστολή του ανακοίνωσε το ενδιαφέρον του στην αναζήτηση πιθανών χρήσεών της σε περιπτώσεις καρδιοπάθειας ή νευρικής κατάπτωσης. Με βάση την προσωπική του εμπειρία πάνω στη χρήση της, αλλά και δοκιμές που πραγματοποίησε, ολοκλήρωσε μία μελέτη με τίτλο Περί κοκαΐνης (Über Coca) που εκδόθηκε το 1885. Ο Φρόυντ κατέληγε πως η κοκαΐνη ήταν κατάλληλη για χρήση σε περιπτώσεις νευρασθενειών, δυσπεψίας, καθώς και ικανή να αντικαταστήσει τη μορφίνη. Υπέδειξε επιπλέον ένα μηχανισμό δράσης της, ο οποίος επιβεβαιώθηκε αργότερα, σύμφωνα με τον οποίο, η ουσία δρα διεγερτικά, αναστέλλοντας την επενέργεια των παραγόντων που καταστέλλουν τα σωματικά αισθήματα. Η μελέτη του Φρόυντ έστρεψε την προσοχή των ιατρών στην κοκαΐνη και λίγους μήνες αργότερα, ο οφθαλμολόγος Καρλ Κόλερ επέκτεινε τη χρήση της ανακαλύπτοντας πως λειτουργεί αναισθητικά στο μάτι. Ο Φρόυντ χορήγησε κοκαΐνη στον φίλο και δάσκαλό του Ερνστ Φλάισλ φον Μάρξοφ. Ο Φλάισλ είχε εθιστεί στη μορφίνη, την οποία χρησιμοποιούσε για να αντιμετωπίσει τον πόνο εξαιτίας συνεχούς νεοπλασίας νευρωμάτων στον ακρωτηριασμένο, λόγω μόλυνσης, αντίχειρά του. Ο Φρόυντ πίστευε πως με τη χορήγηση κοκαΐνης θα ξεπερνούσε τον εθισμό του στη μορφίνη, ωστόσο οδήγησε σε χειρότερο εθισμό και χρόνια δηλητηρίαση. Από τον Ιούλιο του 1885 έκαναν την εμφάνισή τους επιθετικές κριτικές στον Φρόυντ, σε σχέση με τη θέση του υπέρ της κλινικής χρήσης της κοκαΐνης, κατηγορούμενος δημόσια πως εξαπέλυε την «τρίτη μάστιγα της ανθρωπότητας» (μαζί με το αλκοόλ και τη μορφίνη).